Detección de proteína priónica patológica ovina mediante inmunohistoquímica en animales provenientes de la XII Región

Detection of ovine patologic prion protein through immunohistochemestry in animals from XII Region

A. Machuca¹, C. Lecocq², C. Jara², G. Farías^1*

¹Universidad de Chile. Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias. Departamento de Patología Animal. Lab. Fisiopatología y Toxicología.

²Departamento de Laboratorios y Estación Cuarentenaria Pecuaria. Unidad de Patología.

Fax # 9785614 Casilla 2 correo 15 La Granja.

^{*gfarias@uchile.cl}

ÍNDICE

Resumen. 21

Abstract 22

Introducción. 23

Materiales y Métodos. 24

Resultados. 26

Discusión. 31

Resumen

Las encefalopatías espongiformes transmisibles (EETs) son un grupo de enfermedades neurodegenerativas, de progresión lenta y finalmente fatales. Afectan tanto a humanos como a los animales. Dentro de éstas, los ovinos pueden presentar el Scrapie, que fue descrito hace más de 250 años.

El agente etiológico del Scrapie y del resto de las encefalopatías espongiformes, se denomina “prión” (partícula infecciosa proteinácea), que corresponde a la forma alterada (PrP^Sc) de una proteína normal constitutiva de la membrana celular (PrP^C). La presentación de la enfermedad está determinada genéticamente, manifestando un cuadro clínico neurológico con cambios de

conducta, tremores e incluso convulsiones, además de prurito, perdida de lana, debilidad y deterioro de la condición corporal.

Desde hace algunos años, Chile ha realizado importantes estudios en relación al diagnóstico de la EEB. Sin embargo, para el scrapie esto ha sido más lento. Por este motivo se buscó demostrar que la técnica de inmunohistoquímica es completamente confiable para ser utilizada como herramienta diagnóstica del Scrapie, bajo las condiciones particulares del laboratorio oficial del país, perteneciente al Servicio Agrícola y Ganadero (SAG).

Se procesaron 100 muestras de óbex ovinos mayores de 2 años, sacrificados en mataderos de la XII región, con el propósito de aplicar una técnica inmunohistoquímica, además de describir los hallazgos histopatológicos más importantes a través de una tinción de H-E modificada, utilizada para el diagnóstico de las EETs.

En relación al análisis de los resultados, la totalidad de las muestras fueron negativas a Scrapie mediante inmunohistoquímica. Por otra parte, a través de la tinción histopatológica de H-E modificada, se observaron lesiones microscópicas inflamatorias, hemorrágicas, pigmentarias y otras, las que resultaron ser inespecíficas, sin asociase a ninguna enfermedad en particular.

Así, la realización de la inmunohistoquímica presentó 100% de sensibilidad y especificidad, reafirmando que esta técnica es confirmatoria para el diagnóstico del Scrapie, tal y como lo recomienda la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE).

Abstract

Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) are a group of neurodegenerative diseases, slow progression and finally fatal. Affect both humans and animals. In last these, ovines can be afeccted by a disease that has been recognized for long two centuries that is called scrapie.

The etiologic agent of scrapie, and other spongiform encephalopathies, is called “prion” (proteinaceus infectious particle). It is an altered form (PrP^Sc) of a constitutive membrane cellular (PrP^C). The presentation of the disease is determined genetically, demonstrating a clinical neurological pattern with changes of behavior, tremors and even convulsions, besides pruritus, loss of wool, weight loss.

Currently, the country possesses several diagnostic technologies to the bovine spongiform encephalopathy (BSE), but it haven’t for scrapie. Because of this, the aim of this research is demonstrate that inmunohistochemistry is completely reliable to be used as diagnostic tool for scrapie, under the particular conditions of the official laboratory of this country, belonging to the Servicio Agricola y Ganadero (SAG).

One hundred samples of nervous tissue to level of obex were processed, which ones were obtained from healthy clinical ovines over 2 years old that were sacrificed at slaughterhouses of the XII region, in order to apply immunohistochemistry. Besides, describing the more important histopathologic findings by a modified Hematoxiline Eosine dye, in the sames samples. All the samples were negative to inmunohistochemistry. On the other hand, in the same samples could be observed hemorrhagic and inflammatory injuries by microscopic histopathology technique.

The accomplishment of the immunohistochemestry presented 100 % of sensibility and specificity, reaffirming that is confirmatory for the diagnosis of the Scrapie, like it is recommended by the World Organization of Animal Health (OIE).

Palabras claves: Scrapie, Prion

Key words: Scrapie, Prion

Introducción
Las enfermedades priónicas, también llamadas Encefalopatías Espongiformes Transmisibles (EETs), corresponden a una de las enfermedades más intrigantes que afectan el sistema nervioso de los humanos y animales (Castilla et al., 2005). En éstos últimos se destaca el Scrapie, que es una enfermedad neurodegenerativa que afecta a las especies domésticas ovina y caprina, siendo el prototipo de las EETs. El primer registro descrito ocurrió en Gran Bretaña en el año 1732. A partir de esa época, el Scrapie se hizo endémica en varios otros países de la comunidad europea, así como también en el continente americano, donde importantes países como Canadá y Estados Unidos presentan esta enfermedad hasta ahora, sin poder eliminarla (Detwiler y Baylis, 2003; OIE, 2004; Defra, 2006).

Sólo en la década de los 80, el Scrapie adquiere una mayor importancia, ya que se le vinculó con la aparición de la EEB en 1986, la que a su vez daría origen a una nueva variante de la enfermedad de Creutzfeld Jacob (vECJ) en 1996 (Andrews et al., 2003; Aguzzi, 2006).

El agente causal del Scrapie, así como de las EETs son los priones, los cuales han sido definidos como pequeñas partículas infecciosas proteináceas, que resisten la inactivación mediante procesos que modifican los ácidos nucleicos. Se les designó PrP, del inglés prion protein. Se describen dos formas para este agente, una PrP normal, la cual es susceptible de ser degradada por proteasas y la otra causante del Scrapie y de las EETs, la cual es resistente a la degradación por proteasas. Así se designó PrP^C a la proteína normal, y PrP^Sc a la forma patológica (Prusiner, 1998).

La infección del Scrapie, antes de su detección en el sistema nerviosos central, se ubica en primera instancia en el sistema linforreticular, el cual incluye tonsilas, bazo, linfonódulos retrofaringeos y mesentéricos como las Placas de Peyer (Collinge, 2005). Para que ésta ocurra, la PrP^Sc debe ingresar al organismo del animal, lo que ocurre principalmente a través de la vía oral (Gossner et al., 2005), aunque se describen otras rutas como la vía conjuntival y las lesiones de la piel o “escarificaciones” de ésta (Detwiler y Baylis, 2003). Posterior a la replicación de los priones en el sistema linforreticular, se produce la propagación hasta el sistema nervioso central, ascendiendo vía médula espinal o nervio vago. En ese lugar los priones ejercen sus efectos destructivos, causando la sintomatología clínica de la enfermedad (Collinge, 2005).

El cuadro clínico se presenta entre los 2 y los 5 años de edad, previa incubación que puede durar desde 11 a 22 meses. El curso clínico es usualmente prolongado, entre1 a 6 meses, aunque se han reportado animales muertos sin exhibir signología clínica antes de morir. Las manifestaciones de tipo nerviosas caracterizan el cuadro clínico del Scrapie, se presentan con respuestas exageradas ante estímulos externos o simplemente los animales afectados son torpes, con miradas “fijas” y cabeza baja. Otros signos importantes son el prurito, que desencadena lesiones secundarias en la piel y perdida del vellón, anormalidades motoras y movimientos involuntarios (tremores), además de la pérdida de la condición corporal (CRL, 2004).

Desde el año 1990 Chile ha adoptado una serie de medidas en el marco de un programa de prevención de la EEB y el Scrapie. Sin embargo, estas medidas apuntan directamente a la encefalopatía que afecta al ganado bovino (SAG, 2007). Pese a esto, el Scrapie sigue siendo una enfermedad potencialmente peligrosa, no sólo por los problemas económicos que podrían tener los estancieros de nuestro país, sino por las posibilidades ciertas de que pueda afectar a la población bovina y/o humana. El Scrapie no se ha presentado como un riesgo directo para la salud humana (Detwiler y Baylis, 2003; Concepcion et al., 2005), sin embargo, existe una posibilidad teórica, ya que en el Reino Unido se ha demostrado la presencia de la EEB en los ovinos (Nonno et al., 2003; CRL, 2004; Bellworthy et al., 2005; Jeffrey et al., 2006).

A partir de esta perspectiva, se hace necesario contar con las técnicas diagnósticas específicas para el Scrapie, las cuales son utilizadas y aprobadas por organismos internacionales. En este contexto se enmarcó este estudio, en el cual se buscó demostrar que la técnica de inmunohistoquímica es completamente confiable para ser utilizada como herramienta diagnóstica del Scrapie, bajo las condiciones particulares del laboratorio oficial país, perteneciente al Servicio Agrícola y Ganadero.

Materiales y Métodos

Se procesaron 100 muestras de óbex de ovinos obtenidos en mataderos de la XII Región, de animales mayores de 2 años, sin importar raza ni sexo. Éstas fueron inmersas en una solución neutra de formalina al 10% para su fijación durante 7 días. Pasado este tiempo se laminaron, procesaron y cortaron con la finalidad de realizar cortes histológicos de 5 mm de grosor (Machuca, 2006). De cada muestra de óbex se obtuvieron cortes seriados, que fueron montados en portaobjetos. Para la realización de una tinción de hematoxilina eosina modificada para EEB, en algunos cortes se practicó la técnica de histopatología utilizada en forma rutinaria, mientras que en otros que fueron montados en portaobjetos con carga eléctrica, se realizó la técnica histoquímica (IHQ). Para ésta, los portaobjetos fueron sometidos a calor durante 30 min a 60ºC, y luego durante toda la noche en una estufa de secado a 37ºC. Posteriormente, fue necesario hidratar los tejidos sometiéndolos a baños de xilol y etanol en graduación decreciente como se indica en Arnaíz (2004).

Tinción histopatológica. Los cortes destinados a esta tinción fueron teñidos con hematoxilina y eosina modificada para EETs, las cuales permiten apreciar de mejor forma las vacuolas que se presentan en tejidos que son positivos a la enfermedad. El protocolo de tinción fue similar al utilizado en otros trabajos (Araya, 1999; Ayala, 2001; Arnaíz, 2004).

Técnica inmunohistoquímica. Para inhibir la actividad endógena de peroxidasa que presenta el tejido, muestras se mantuvieron en una solución de agua oxigenada al 3% en metanol absoluto durante 10 min. Luego fueron sumergidas en agua bidestilada e incubadas en ácido fórmico al 98% durante 5 min a temperatura ambiente, se lavaron y neutralizaron en una solución tampón Tris-HCl, 0,1 M, pH 7,6 2 min. Las muestras fueron transferidas a una solución recuperadora de antígenos pH 7,6 (Target Retrieval Solution®), e incubadas en un autoclave durante 20 min a 120ºC. Se enfriaron, en la misma solución a temperatura ambiente para transferirlas a una solución de TBST pH 7,6 (Tris Buffer Salino-Tween 20) por 10 min para realizar la Inmunohistoquímica mediante la técnica de capilaridad Los portaobjetos fueron montados en un sostenedor siguiendo el protocolo del kit Pullman Monoclonal F99/97.6.1 (VRMD, Inc., 2004). Para esto, se agregaron 150 ml de solución de proteinasa K en cada pocillo de un dosificador (Isolon®) en los que se incubaron por 90 seg a temperatura ambiente, seguidos de 3 lavados con TBST pH 7,6. Posteriormente, se agregaron 150 ml de anticuerpo primario monoclonal F99/97.6.1 (Spraker et al., 2002) en una dilución 1:1000, incubando las muestras por 15 min a 37ºC, seguida de 3 lavados con TBST pH 7,6. Luego, se sometieron a la incubación con un anticuerpo secundario policlonal anti-ratón biotinilado y streptavidina – HRP, para finalizar con el revelado de la reacción inmunológica mediante la incubación protegida de la luz directa con sustrato de cromógeno AEC, durante 20 min. La reacción se detuvo con lavados de agua bidestilada. Por último, se tiñó el parénquima nervioso de cada muestra con hematoxilina de Mayer´s durante 10 min (Arnaiz, 2004; Machuca, 2006). Para esta técnica se utilizaron controles positivos y negativos aportados por organismos canadienses (National referente Laboratory for Scrapie and CWD, Animal Research Institute y Canadian food Inspection Agency).

Análisis de las muestras. Para el estudio histopatológico, el análisis de los resultados se realizó de acuerdo a los criterios recomendados por el Veterinary Laboratories Agency (VLA, 2003), así las muestras se clasifican como positivas, negativas o sospechosas de acuerdo a la presencia de vacuolización distribuída en forma simétrica y bilateral en los núcleos dorsal del vago, del tracto espinal del trigémino y del tracto solitario a nivel de óbex. Los positivos presentarán al menos tres vacuolas en el neuropilo de cualquiera de los núcleos mencionados, las negativas no presentarán tales lesiones y las sospechosas se caracterizarán por la presencia de vacuolización insuficiente como para efectuar una confirmación histopatológica de acuerdo al criterio enunciado para las muestras positivas.

Por otra parte, el análisis inmunohistoquímico de los resultados se basó en las pautas del Laboratorio Nacional de Referencia para Scrapie y CWD de Ontario Canadá (Arnaíz, 2004; Machuca, 2006), el que determina una muestra positiva si presenta inmunotinción específica en compañía de lesiones vacuolares en las mencionadas zonas anatómicas del óbex. Una muestra es negativa ante la completa ausencia de inmunotinción específica, con o sin lesiones vacuolares. Por último, una muestra es sospechosa a la inmunohistoquímica si presenta inmunotinción no aclaratoria en las zonas anatómicas del óbex.

Resultados

Del análisis histopatológico de las muestras de óbex, como se muestra en la Tabla 1, se apreció que 87 de las muestras no presentaron lesiones características, mientras que en las 13 restantes se observaron alteraciones de tipo inflamatorias (9), de las cuales 8 correspondieron a manguitos perivasculares (MPV), formados principalmente por células de tipo linfocitarias (Figura 1a), y una a gliosis conformada por células de la oligodendroglia. En 3 de los cortes se demostró la presencia, en el parénquima nervioso a nivel de óbex, de lesiones hemorrágicas en un grado moderado (Figura 1b). Solamente en uno de las muestras analizadas por la tinción histopatológica utilizada de rutina, se pudo observar melanosis meningea a nivel de óbex (Figura 1c).

Tabla 1. Resumen de la clasificación de las lesiones microscópicas encontradas en las muestras de óbex ovino con la tinción de H-E modificada para EETs.

	Lesiones Inflamatorias		Lesiones hemorrágicas	Lesiones Pigmentarias	SIN LESIONES	TOTAL
	MPV 8	GLIOSIS 1	3	1	87	100
TOTAL	9		3	1	87	100

MPV: Manguitos perivasculares. n=100.

Figura Nº1a. Fotografía microscópica de un corte a nivel de óbex, en la cual se observa un manguito perivascular que se conforma por células inflamatorias (flechas), en su mayoría linfocitos, dispuestos alrededor de un vaso sanguíneo (V). (H-E 200X).

V

Figura Nº1b. Microfotografía de un corte histológico de óbex, se observa una lesión de tipo hemorrágica (flechas) alrededor de un vaso sanguíneo (V) en el parénquima nervioso de la médula oblongada. (H-E 200X).

Figura Nº1c. Imagen microfotográfica de un corte histológico de meninges a nivel de óbex, en la cual se muestran melanocitos (flechas) junto con la melanosis meningea (M)(H-E 400X).

Para la técnica de inmunohistoquímica, se demostró que el 100% de las muestras provenientes de la XII región resultaron negativas a Scrapie (Tabla II). La totalidad de los controles positivos (20) presentaron el precipitado de color rojo, lo cual indica la localización de la proteína priónica patológica (PrP^Sc) (Figura 2). Por otra parte los controles negativos utilizados (20) no presentaron inmunotinción ni vacuolas espongiformes (Figura 3). Esto nos confirma que las muestras en estudio son realmente negativas a Scrapie mediante la técnica de inmunohistoquímica (Figura 4).

Figura Nº2. Microfotografía de un corte histológico de la médula oblongada a nivel de óbex sometido a la tinción IHQ. En ella se observa el núcleo de tracto solitario con presencia de numerosas vacuolas (círculos) y precipitado de color rojo (R) dado por el cromógeno AEC, lo cual indica presencia de PrP^Sc. (IHQ 200X).

Figura Nº3. Fotografía de la imagen microscópica de un corte de la médula oblongada a nivel de óbex de ovinos, que corresponde a un control negativo para la tinción IHQ. Se observa el tejido nervioso (N) y los somas neuronales (flechas) teñidos con hematoxilina de Mayer. (IHQ 200X).

Figura Nº4. Fotografía de la imagen microscópica de la médula oblongada a nivel de óbex de una muestra en estudio sometida a tinción IHQ. Se muestra el núcleo dorsal del nervio vago (D) en que no se observa precipitado de color rojo, lo que indica negativo a Scrapie (IHQ 100X).

Tabla 2: Resumen de los resultados obtenidos en las muestras de óbex ovinos sometidos a la prueba de inmunohistoquímica (IHQ).

INMUNOTINCIÓN	CONTROLES	MUESTRAS ANALIZADAS	TOTAL
POSITIVA	20	0	20
NEGATIVA	20	100 (100%)	120
SOSPECHOSA	0	0	0
TOTAL	40	100 (100%)	140

n = 140

Discusión

El Scrapie es una enfermedad endémica en Europa y Norteamérica desde hace 250 años, sin embargo, como aún no se ha descrito en Chile, no se han iniciado programas intensivos de vigilancia epidemiológica como ha ocurrido para EEB, así como tampoco se han estandarizado las pruebas necesarias para la prevención y control de esta encefalopatía que afecta a ovinos y caprinos. Esto debería realizarse con el propósito de demostrar al mercado internacional que el país está libre de esta enfermedad que afecta a los pequeños rumiantes.

En el presente estudio se realizaron 2 técnicas diagnósticas para Scrapie, la inmunohistoquímica, método avanzado y reconocido internacionalmente y por otra parte, la histopatología, utilizada rutinariamente en nuestro país. Para esta última se utilizó una tinción de H-E modificada para EETs, lo cual permite un mejor contraste del tejido nervioso para la visualización de las vacuolas que pudieran estar presentes en las muestras (Araya, 1999; Ayala, 2001). El análisis de las muestras con H-E permitió observar en el tejido nervioso ovino lesiones microscópicas de otro tipo diferente a las producidas por la PrP^Sc, como son las inflamatorias (figura Nº2), hemorrágicas (figura Nº3) y pigmentarias (figura Nº4), que se mostraron en los resultados de este ensayo. Estos resultados coincidieron con los encontrados en bovinos (Araya, 1999; Arnaiz, 2004), y en ovinos (Ayala, 2001; Machuca, 2006) utilizando la misma técnica, en los que las principales lesiones encontradas fueron los infiltrados inflamatorios linfocitarios asociados a vasos sanguíneos (manguitos perivasculares), astrogliosis, microhemorragias y presencia de melanina a nivel de meninges.

Por otra parte, al analizar los resultados de la inmunoreacción que se presentaron con la IHQ, éstos coincidieron con los encontrados con muestras de bovinos (Arnaíz, 2004), por lo que se concluyó que, como en la totalidad de las muestras no se observó inmunotinción específica, así como tampoco lesiones vacuolares en las zonas anatómicas específicas del óbex, todas las muestras fueron negativas a Scrapie con la técnica de inmunohistoquímica. En este caso, el método inmunohistoquímico se realizó bajo las condiciones del laboratorio oficial de diagnóstico de las EETs en Chile (Laboratorio de Patología Pecuaria Lo Aguirre, perteneciente al SAG) el cual presentó un 100% de sensibilidad y de especificidad para Scrapie (Tabla 2), lo cual concuerda con Manning et al. (2001).

Pese al mayor tiempo demandado para su realización, en comparación a las pruebas denominadas “rapidas” como el ELISA y el Western Blot (Farías et al., 2004; 2005), la IHQ presenta importantes ventajas, ya que puede ser realizada con otros tejidos distintos al sistema nervioso central alcanzando muy buenos resultados, tal y como lo demuestran los estudios de Monleón et al. (2005) y González et al. (2006). Además, el diagnóstico inmunohistoquímico puede ser realizado en tejido linfoide (nódulos linfáticos y biopsias de tercer párpado), permitiendo detectar casos positivos en animales vivos que estén cursando la etapa preclínica de la enfermedad (O’Rourke et al. 2000; Thuring et al. 2005). De acuerdo a esto, y sumado a lo descrito por Monleón et al., (2005), que planteó que algunas pruebas rápidas pueden no detectar la PrP^Sc de origen ovina en muestras de tejido nervioso, se puede afirmar que la inmunohistoquímica es la prueba más confiable, segura y confirmatoria para el diagnóstico del Scrapie, en relación a otras técnicas de inmunodiagnóstico, como son las pruebas rápidas: Western Blot y/o el inmunoensayo enzimático (ELISA), tal y como lo reconoce la OIE desde el año 2000.

Hasta hace poco tiempo atrás, Chile sólo contaba con una prueba de inmunodiagnóstico para el Scrapie (Western Blot), por lo que se hacía necesario contar con la inmunohistoquímica como herramienta diagnóstica estandarizada a las condiciones del laboratorio oficial. Por otra parte, el Western Blot utiliza sólo muestras de tejido nervioso congeladas, los cuales presentan una mayor probabilidad de ser clasificadas como no aptas, por autolisis del tejido, lo cual no permite la realización específica de este tipo de diagnóstico en forma certera. Sin embargo, este tipo de muestras sí podrían ser sometidas a inmunohistoquímica obteniendo buenos resultados, tal y como lo describen Debeer et al. (2001). Además, estos autores en el 2002 concluyen que la inmunohistoquímica podría ser realizada también con muestras que fueron congeladas por error (Debeer et al. 2002). Aunque en un futuro próximo pudiera existir en el país otra técnica inmunológica de diagnóstico rápido (ELISA), la prueba confirmatoria internacional seguirá siendo la IHQ, al igual como ocurre en el diagnóstico de la EEB (OIE, 2000).

El objetivo fundamental al que apunto este estudio fue conocer la realidad del Scrapie en Chile de acuerdo a los estandares internacionales, puesto que el Scrapie silenciosamente podría convertirse en una enfermedad potencialmente transmisible y zoonótica, puesto que, si bien no se ha demostrado completamente su paso directo al humano, sí podría llegar a esta especie indirectamente a través de la EEB.

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